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外周造血干细胞采集与冻存质量分析

发布时间:2020-07-31 10:44:46

  外周造血采集与冻存质量分析

  方法选取本院2014年7月至2016年7月收治的41例自体外周造血干细胞移植患者为研究对象,经化疗联合粒细胞集落刺激因子进行造血干细胞动员,应用血细胞分离机进行86例次自体外周造血干细胞采集,经流式细胞术检测干细胞含量,采用以羟乙基淀粉为主的冻存体系,定期检测干细胞活率,结合自体干细胞移植的成功率,评价造血干细胞采集及冻存的有效性和安全性。

  结果化疗间歇第9~11天,CD34+≥15个/μl,达到采集标准;经1~3次采集CD34+细胞≥2×106/kg,单个核细胞数≥2×108/kg,符合自体干细胞移植标准;1~6个月冻存活率≥94%,回输前1周复测干细胞活率≥96%。移植后平均+9天粒系植入,平均+13天巨核系植入。中位随访12个月,患者无病生存率达98%。

  结论自体外周造血干细胞采集冻存质量符合标准,为自体造血干细胞植活及移植的成功提供了根本保障。

  关键词造血干细胞移植;外周造血干细胞;干细胞采集;干细胞冻存

  外周血造血干细胞移植是根治恶性血液病的有效手段。针对恶性淋巴瘤、骨髓瘤及无人类白细胞抗原配型相合供者的患者,自体外周造血干细胞移植(autologousperipheralbloodstemcelltransplantation,APBSCT)可作为治疗的选择之一[1]。其优势在于移植后并发症少,成功率高,治疗费用经济,无排异风险。自体外周造血干细胞的采集数量、冻存质量及活率是决定APBSCT成功的重要因素。本院2014年7月至2016年7月完成了86例次自体造血干细胞的采集及冻存,笔者将41例患者的86例次采集结果全部纳入本研究进行分析,以监测自体外周造血干细胞采集与冻存质量,提高自体造血干细胞移植的疗效。

  1、资料与方法

  1.1、一般资料

  选取本院2014年7月至2016年7月收治的41例APBSCT患者为研究对象,完成自体外周造血干细胞采集86例次;男25例,女16例;年龄15~59岁,平均37岁;其中非霍奇金淋巴瘤18例,多发性骨髓瘤14例,霍奇金淋巴瘤4例,急性白血病3例,POEMS综合征2例。

  1.2、干细胞动员

  采用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)化疗联合粒细胞集落刺激因子(colonystimulatingfactor,G-CSF)方案动员。CTX使用方法为2~3g/m2单次或分2日静脉滴注,G-CSF通常在化疗间歇期第5~7天,白细胞计数降至最低点时应用。G-CSF每日用量为5~10μg/kg,分早晚两次皮下注射,持续使用至采集当日清晨。每日监测血常规及外周血CD34+计数,当CD34+≥15个/μl即达到采集标准。

  1.3、采集前准备

  1.3.1、患者准备

  采集前一周食用高蛋白、高维生素饮食,采集前一晚开始改用低脂饮食,禁忌空腹。提前做好皮肤清洁,保持充足睡眠。暂停使用影响凝血功能的。

  1.3.2、血管评估及置管

  采集前需评估血管情况,以粗直弹性良好的肘部血管(肘正中静脉、头静脉、贵要静脉)为首选。如肘部血管不理想,需进行股双腔中心静脉置管(型号为PVC11.5FR),以保证较好的采集压力及流速。

  1.4、外周造血干细胞采集

  1.4.1、仪器与管路

  采用SpectraOptia血细胞分离机(TerumoBCT公司)7.2版本软件及一次性使用血细胞收集管路(TerumoBCT公司)。

  1.4.2、干细胞采集过程

  提前做好采集室环境及被服消毒,检测血细胞分离器性能是否完好,选择单个核细胞采集程序。建立2条静脉通路,以收集管路自带钢针或股中心静脉作为出路,密闭式静脉留置针(BD竸玛型号18G)建立回路。启动预冲,抗凝剂为血液保存液Ⅰ(ACD-A配方抗凝剂),速率为1.5~4.9ml/min。全血与抗凝剂比例为(10~12)︰1,采血流速为27.2~58ml/min。一般成人全血容量为3076~6768ml,循环血量设置为全血容量的2~3倍,约8510~14000ml,采集物体积为108~552ml。采集时间为4~7小时,因时间较长需保证患者舒适体位,协助完成大小便及饮食等生活需要,避免进食含水量多的食物,减少因排尿造成体位改变影响采集压力。采集前3天口服D3片(批号:国药准字H10950029;规格:每片含钙600mg/维生素D3)每日2片。采集过程中密切观察患者的生命体征,每2小时口服注射液(批号:国药准字1160928103;规格10ml﹕1g)20ml,必要时以葡萄糖酸钙注射液20ml加入0.9%氯化钠注射液500ml中与采集同步滴注,防止发生低血钙反应。

  1.4.3、采集后护理

  拔管后,做好穿刺部位的护理;患者平躺15~30分钟,起床动作需缓慢,自觉口渴或饥饿应进食,防止发生低血糖。建议休息1周,禁止从事重体力劳动,加强营养摄入。

  1.5、干细胞冻存与活率监测

  冻存液配置方法:终浓度5%羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch,HES)+10%二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)+15%人血清白蛋白。冻存液与干细胞比例为2︰1,40ml分装为1袋。置于-80℃环境中冷冻保存,分别于每个月及干细胞回输前1周、3天、1天监测样本活率。经37℃水浴复苏后将干细胞快速回输至患者体内。回输后第1天标记为自体造血干细胞移植+1天。

  2、结果

  2.1、干细胞动员效果

  干细胞动员过程中,23例患者无任何不适,18例患者出现低热、头痛、腰背肌肉酸痛等不适反应。干细胞采集当天外周血细胞计数均值如下:白细胞为(27.56&plun;14.36)×109/L,血红蛋白为(110±19)g/L,血小板为(130±80)×109/L,血细胞比容为(33.7±5.4)%。干细胞动员后CD34+百分比见图1,CD34+细胞平均值见图2。平均于化疗间歇第9~11天进行细胞动员,动员后4~6天内CD34+细胞数目达到采集标准。

  2.2、造血干细胞采集质量

  经1~3次采集后,采集物CD34+细胞数≥2×106/kg,单个核细胞数≥2×108/kg,符合APBSCT要求。41例患者的86例次自体外周造血干细胞采集中8例患者1次采集达标,21例患者2次采集达标,12例患者3次采集达标。单次采集质量分析,采集物体积为(276.5±102.4)ml,单个核细胞含量为(4.6±3.3)×108/kg,CD34+细胞含量为(3.8±3.0)×106/kg,采集物CD34+百分比为(0.4±0.3)%。

  2.3、自体造血干细胞冻存活率监测

  冻存1~6个月,干细胞冻存活率≥94%。分别于回输前1周、3天、1天监测干细胞冻存活率,结果显示干细胞冻存活率≥96%(图3)。

  2.4、采集的不良反应及处理

  本研究中86例次自体外周干细胞采集,发生枸橼酸钠不良反应12例次,其中1例次出现胸闷、恶心、呕吐症状,其余表现为口唇及指尖麻木。经过积极补钙对症处理,所有不良反应均于采集后4小时内消失。

  2.5、血管通路选择

  36%的自体造血干细胞采集患者使用了股中心静脉置管。

  2.6、异常报警及处理

  釆血压力不足是血细胞分离机采集运行中的常见报警原因。5例次自体干细胞采集出现压力报警,予以穿刺部位热敷加压、调整针尖位置、生理盐水冲管等方法使采集压力得到有效改善。1例次出现干细胞收集器堵管,调整全血与抗凝剂比例为8︰1后,凝块逐渐溶解。所有异常报警均于3分钟内处理完毕,采集效果未受影响。

  2.7、自体外周造血干细胞移植后造血重建及生存情况

  41例APBSCT患者在干细胞回输后2周内均获得造血重建,粒系植入时间为回输后第7~12天,平均第9天;巨核系植入时间为回输后第11~16天,平均第13天。随访2~22个月,中位随访时间为12个月,1例患者在移植后4个月复发死亡,其余患者均未出现移植复发死亡,中位无病生存率为98%。

  3、讨论

  自体造血干细胞移植是目前能够使血液系统恶性疾病(如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)患者长期存活的治疗手段之一。预处理方案是造血干细胞移植的关键环节,其在尽可能杀伤肿瘤细胞的同时,也损伤了正常的造血组织和造血细胞。移植前采集和冻存高质量的外周造血干细胞,才能保证移植患者的安全,促进造血重建,是移植成功的重要保障,因此造血干细胞有效的采集和冻存方法是移植成功的关键因素。

  首先,股中心静脉置管是保证造血干细胞顺利采集的重要条件。由于自体造血干细胞采集者常在采集前接受过若干疗程化疗,血管受到一定损伤[2],外周静脉穿刺极为困难。因此,寻找合适的血管是保证顺利采集的关键因素。对于血管条件不理想者,为减少其因反复穿刺造成的紧张情绪和痛苦感,常以股双腔中心静脉置管作为通路。因股静脉容易穿刺,且双腔导管管径大,血流充足,管壁较厚,不会在抽吸过程中发生管路塌陷[3],可以保证良好的采集及回流压力,提高外周造血干细胞采集效率。本研究结果显示,在干细胞动员后第2天,外周造血干细胞含量和百分比逐步升高,65%的患者在动员5天内达到采集要求,动员过程中44%的患者出现轻微不适,动员结束后症状消失,动员效果未受到影响。提示该动员方案可作为自体干细胞动员采集的常规方案。随着动员时间和采集次数的增多,患者外周造血干细胞的含量呈下降趋势,因此,应在动员后第4~6天内完成外周造血干细胞采集。

  采用SpectraOptia血细胞分离机进行外周造血干细胞采集,界面操作简单,指导方式清晰易行,采集效率高。多数研究认为CD34+细胞数≥2×106/kg是移植成功的阈值[2,4],本院自体外周干细胞采集1~3次可达到移植要求,干细胞采集后血小板平均下降35.7%[5]。因此,SpectraOptia血细胞分离机是简单便捷的采集仪器之一。外周造血干细胞采集与骨髓采集相比,创伤小,避免了硬膜外麻醉并发症及术中失血、感染、损伤等危险因素,安全可行。抗凝剂枸橼酸钠的不良反应是采集中最常见的不良反应之一。常见表现为口周、面部或肢体末端麻木、恶心、呕吐、胸闷等。原因是枸橼酸钠螯合血液中钙离子,形成不能离子化的枸橼酸钙,引起血液中钙离子水平下降[6]。不良反应以低血钙反应为主,症状轻微,患者可耐受。

  外周造血干细胞的冻存液的组合有多种,如终浓度为3.5%DMSO+1%人血清白蛋白+2.5%HES[7]或10%DMSO+8%人血清白蛋白+12%HES[8],也可以自体血浆代替人血白蛋白[9],DMSO的浓度亦各不相同[10],但合理的组合都会达到良好的长期冻存效果,并不影响自体造血干细胞的植入和造血恢复[11-13]。本院采用的以HES为主的冻存体系,方法便捷,价格低廉。干细胞活率监测简单易行,冻存1~6个月其活率可保证在94%以上。因此该冻存方法值得推广。应用本冻存方法冻存的外周血造血干细胞,其移植疗效与文献报道的淋巴瘤与多发性骨髓瘤自体造血干细胞移植的无病生存率吻合[14,15]。

  综上所述,本院造血干细胞的采集和冻存方法显示出良好的安全性,为APBSCT的成功奠定了良好基础。


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